Het libretto voor Mazeppa is geschreven door Viktor Petrovich Burenin, gebaseerd op het gedicht Poltava van Poesjkin. Tsjaikovski bracht er echter wijzigingen in aan en verving de tekst van Burenin waar mogelijk door die van Poesjkin, zonder de focus van eerstgenoemde op de hoofdpersoon, Mazeppa, te verliezen en zonder de grotere historische reikwijdte van laatstgenoemde te omarmen. De opera bestaat uit drie bedrijven en zes scènes en speelt zich af in het Rusland van het begin van de achttiende eeuw. Maria, dochter van de rijke Kozak Kochubei, verklaart haar liefde voor de veel oudere Mazeppa. Andrei kondigt vervolgens zijn hartstochtelijke liefde voor haar aan. Mazeppa vraagt om de hand van Kochubei, zijn dochter, maar wordt geweigerd. Kochubei's plan om Mazeppa's anti-tsaristische intriges aan de tsaar te onthullen, werkt averechts en belandt in een kerker. Ondertussen onthult Mazeppa zijn plannen aan Maria, die niets weet van de gevangenschap van haar vader. Liubov, Maria's moeder, brengt haar op de hoogte van het lot van haar vader. Maria haast zich om haar vader te redden, maar arriveert vlak nadat hij is onthoofd. Tijdens de Slag om Poltava valt Andrei Mazeppa in een hinderlaag, die hem vervolgens neerschiet. Maria troost de stervende Andrei, terwijl Orlik Mazeppa wegsleept.
